近期，许多同学向小尚反馈细胞复苏不理想。细胞复苏作为细胞培养中的常规操作，其过程中的许多细节容易被忽视，而复苏的成功与冻存及复苏的操作密切相关，稍有不慎可能会导致严重后果。本篇文章将从冻存的角度进行分析，下周将更新复苏操作的原因排查，欢迎同学们收藏关注。

首先，让我们回顾冻存的基本步骤：

1. 提前准备好冻存液备用；

2. 离心获取细胞沉淀后，加入冻存液轻轻重悬细胞；

3. 将细胞悬液转移至冻存管中；

4. 若使用程序冻存液，则需将冻存管放入程序冻存盒中，随后置于-80℃冰箱中过夜，再转入液氮保存；若使用非程序冻存液，则可直接冻存。

▶ 常见错误操作：

1. 使用常规含血清冻存液（培养基+血清+DMSO）时，未采用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施。降温过快易形成冰晶，导致细胞破裂死亡。推荐使用程序冻存盒确保降温速度为1℃/min；如没有冻存盒，可将冻存管放在泡沫盒中，于4℃静置5-10分钟，再于-20℃静置2小时后转入-80℃过夜，第二天再进行液氮保存。

2. 冻存前细胞状态不佳或冻存密度过低。保证细胞状态良好是复苏成功的前提，建议选择处于对数生长期且汇合度超过80%的细胞进行冻存。如果发现冻存前培养上清呈橘黄色，建议更换培养液并静置培养4小时再进行冻存。冻存密度应控制在200-300万/mL/管。

3. 直接将DMSO加入细胞悬液而未提前配制冻存液。DMSO在稀释时会释放热量，可能对脆弱细胞造成伤害，因此应提前配制冻存液再处理细胞。

4. 冻存液重悬细胞后直接放入液氮。未经-80℃的梯度降温，直接在液氮中会导致细胞死亡。应确保细胞经过适当的温度调整后再放入液氮中。

5. 冻存液配方不当。研究表明，5%-10%的DMSO最适用于细胞冻存，具体比例应根据细胞种类调整。对于特别敏感的细胞，建议降低DMSO浓度。同时，需根据细胞培养的难度调整血清比例。无论使用何种冻存液，建议进行冻检，以确认细胞状态良好后再进行大批量冻存。

6. 冻存条件不当或冻存时间过久。液氮储存的稳定性明显优于-80℃冰箱，因此如有条件最好采用液氮保存。未配备液氮罐的学生，可将冻存管放置在-80℃冰箱内部的稳定位置，并定期检测细胞活性。

在细胞培养和冻存操作中，确保每一个细节得以实施非常关键。南宫28NG相信品牌力量，致力于提供更优质的科研环境与服务。未完待续，敬请关注！